飲料中霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法與質(zhì)量控制技術(shù)研究

一、方法原理與標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)

飲料中霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)是評(píng)估產(chǎn)品微生物污染程度的關(guān)鍵指標(biāo)，其檢測(cè)依據(jù)為GB 4789.15-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》。該方法通過(guò)梯度稀釋樣品，將適當(dāng)稀釋度的菌懸液涂布于選擇性培養(yǎng)基（如孟加拉紅培養(yǎng)基），在28℃±1℃培養(yǎng)5天后，根據(jù)菌落形態(tài)和數(shù)量計(jì)算霉菌和酵母菌總數(shù)（CFU/g或CFU/mL）。選擇性培養(yǎng)基中的氯mei素可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，孟加拉紅則能減緩菌落蔓延，便于計(jì)數(shù)和鑒別。

二、實(shí)驗(yàn)方法與優(yōu)化

1. 樣品前處理與稀釋

均質(zhì)化處理：對(duì)于含果肉的果蔬汁飲料，稱(chēng)取25g樣品加入225mL無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH 7.0），用均質(zhì)器8000rpm均質(zhì)2分鐘，制成1:10稀釋液。

梯度稀釋?zhuān)喝?mL 1:10稀釋液加入9mL PBS，依次稀釋至10?2、10?3、10??，每級(jí)稀釋更換無(wú)菌吸管，混勻30秒確保菌液均勻分布。

2. 培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

培養(yǎng)基選擇：孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基（含氯mei素50mg/L）或馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA），傾注平板后凝固備用。

接種與培養(yǎng)：選擇2-3個(gè)適宜稀釋度，各取0.1mL稀釋液涂布平板，每個(gè)稀釋度做2個(gè)平行，28℃±1℃培養(yǎng)5天（第3天觀察一次，防止菌落蔓延）。

計(jì)數(shù)規(guī)則：選擇菌落數(shù)10-150個(gè)的平板，霉菌菌落通常呈絨毛狀、絮狀或蜘蛛網(wǎng)狀，酵母菌為圓形、光滑菌落，分別計(jì)數(shù)并計(jì)算平均值。

三、質(zhì)量控制關(guān)鍵技術(shù)

1. 培養(yǎng)基質(zhì)量驗(yàn)證

無(wú)菌性檢查：每批次培養(yǎng)基滅菌后抽取10%樣品37℃培養(yǎng)48小時(shí)，確認(rèn)無(wú)菌落生長(zhǎng)。

促生長(zhǎng)能力：接種標(biāo)準(zhǔn)菌株（如黑曲霉ATCC 16404、釀酒酵母ATCC 9763），28℃培養(yǎng)48小時(shí)，菌落數(shù)應(yīng)在10?-10?CFU/mL范圍內(nèi)，且形態(tài)正常。

2. 操作過(guò)程控制

稀釋操作：嚴(yán)格遵循“一管一吸"原則，避免交叉污染；高粘度樣品（如含乳飲料）可加入無(wú)菌吐溫80（0.1%）改善分散性。

計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性：雙份平行樣品菌落數(shù)相對(duì)偏差應(yīng)≤10%，若差異過(guò)大需重新測(cè)定；菌落蔓延平板需從低稀釋度結(jié)果計(jì)算。

3. 陽(yáng)性對(duì)照與空白實(shí)驗(yàn)

陽(yáng)性對(duì)照：每批次實(shí)驗(yàn)接種10?CFU/mL標(biāo)準(zhǔn)菌懸液，回收率應(yīng)在80%-120%，驗(yàn)證方法有效性。

空白實(shí)驗(yàn)：稀釋液、培養(yǎng)基、吸管等做無(wú)菌性空白，確保實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)無(wú)污染。

四、常見(jiàn)問(wèn)題與解決策略

1. 菌落蔓延與重疊

原因：高糖飲料（如果汁）易導(dǎo)致霉菌菌絲蔓延，酸性飲料（pH＜4.0）可能抑制部分酵母菌生長(zhǎng)。

對(duì)策：添加0.1%去氧膽酸鈉抑制菌絲擴(kuò)展，或采用螺旋平板涂布法減少菌落重疊；酸性樣品用1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.0后培養(yǎng)。

2. 低溫菌與慢生長(zhǎng)菌漏檢

措施：延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至7天，或采用25℃培養(yǎng)以促進(jìn)低溫菌生長(zhǎng)；對(duì)疑似菌落進(jìn)行鏡檢確認(rèn)（霉菌有隔膜菌絲，酵母菌為單細(xì)胞）。

3. 樣品保存與運(yùn)輸

檢測(cè)樣品應(yīng)在4℃冷藏運(yùn)輸，24小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)；無(wú)法及時(shí)檢測(cè)時(shí)需-20℃冷凍保存，解凍后充分混勻。

五、實(shí)際樣品檢測(cè)案例

對(duì)20批市售飲料的檢測(cè)結(jié)果顯示：果蔬汁飲料霉菌和酵母菌污染率最高（15%），其中鮮榨果汁檢出量達(dá)1.2×103CFU/mL；茶飲料和碳酸飲料污染率較低（5%），且菌落數(shù)均＜100CFU/mL。污染原因主要為原料新鮮度不足（如霉變水果）和灌裝環(huán)境潔凈度不夠。

六、結(jié)論

本研究系統(tǒng)闡述了飲料中霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法與質(zhì)量控制要點(diǎn)，通過(guò)優(yōu)化樣品前處理、嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件和加強(qiáng)方法驗(yàn)證，可顯著提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。該方法適用于各類(lèi)飲料的微生物質(zhì)量控制，為保障飲料產(chǎn)品安全提供了技術(shù)支撐。